肽测序（Peptide Sequencing）技术以通过高分辨质谱和生物信息学分析，科研人员得以解析蛋白质的氨基酸序列、翻译后修饰及其动态变化。肽测序（Peptide Sequencing）作为蛋白组学研究中的核心技术，广泛应用于蛋白质鉴定、翻译后修饰分析、新抗原发现、药物研发等领域。然而，然而，肽测序实验中，常因样品质量、酶解效率、质谱参数、数据分析流程等因素，导致结果不理想甚至失败。因此，分析肽测序常见问题与优化建议对于肽测序的技术的提升至关重要，助力科研工作者从失败走向精准。

一、肽测序的常见问题

1、序列覆盖度低，导致蛋白鉴定不全

问题表现：实验结果中部分肽段未被测到，导致整体序列覆盖度低，甚至影响蛋白鉴定结果的可信度。

主要原因：

（1）样品中肽段含量低，未被有效检测

（2）特定肽段因疏水性强、质荷比（m/z）不理想，电离效率低

（3）酶解不完全，产生未预期的肽段

（4）特殊修饰或二硫键导致肽段提取和电离困难

2、测序结果重复性差，重现性低

问题表现：相同样本在多次肽测序实验中结果不一致，重现性差。

主要原因：

（1）样本制备不规范（如蛋白提取、酶解效率波动）

（2）样品浓度与复杂度未优化，导致电喷雾电离（ESI）不稳定

（3）仪器参数设置不合理，如碰撞能（CE）、扫描速率等

（4）实验批次间操作差异（如上样量、流动相梯度）

3、修饰位点识别不准确

问题表现：肽段中的翻译后修饰（PTMs）未被检测或定位错误，影响后续功能研究。

主要原因：

（1）酶解条件未针对修饰位点优化

（2）特定修饰（如磷酸化、糖基化）在MS/MS中信号弱，易丢失

（3）数据库搜索参数设置不当，未考虑修饰质量偏移

（4）仪器分辨率不足以区分同位素峰和修饰峰

4、 异构体和同分异构肽段混淆

问题表现：含有同一氨基酸组成但序列不同（异构体）的肽段在MS/MS中无法区分，导致测序错误。

主要原因：

（1）CID（碰撞诱导解离）或HCD（高能碰撞解离）模式下，异构体产生相似碎片离子

（2）数据库匹配算法缺乏区分同分异构体能力

（3）缺乏辅助信息（如保留时间、同位素分布）进行验证

二、优化肽测序流程的系统建议

1、样品前处理优化：从源头提升信噪比

（1）提高蛋白提取效率：采用多种裂解方法（如超声、尿素缓冲、SDS-PAGE前分离）确保提取效率

（2）精准定量和上样：使用BCA法定量，确保上样浓度合适（常见推荐1-10 µg）

（3）优化酶解条件：控制温度（37°C）、酶与底物比例（1:50或1:100），并结合多酶策略（如Trypsin+LysC）提升酶解完全度

（4）去除盐和污染物：采用固相萃取（SPE）或C18柱脱盐，减少离子抑制

2、质谱平台选择与参数优化

（1）选择高分辨质谱仪：如Orbitrap Fusion、Q-Exactive HF-X，确保高灵敏度和质量精度

（2）合理设置碰撞能：针对目标肽段优化CE，平衡碎片离子丰度与覆盖度

（3）采用多级质谱（MS^n）：对复杂修饰或同分异构体进行更高层次的结构解析

（4）利用动态排除和自动增益控制（AGC）：提高多肽检测覆盖率与动态范围

3、数据库搜索与算法提升

（1）选择全面的数据库：包含翻译后修饰（如UNIMOD库）和特定物种背景

（2）调整搜索容差：对质量偏移设置严格（如MS1: ±10 ppm，MS2: ±0.02 Da）

（3）多引擎交叉验证：结合Mascot、MaxQuant、Byonic等不同搜索引擎，提高识别准确度

（4）引入脱靶质控：采用反向数据库或空白样本，控制FDR（假发现率）在1%以内

4、特殊修饰与同分异构体识别策略

（1）采用ETD/ECD解离：对磷酸化、糖基化等易失修饰，选用电子转移/俘获解离（ETD/ECD）技术，保留修饰信息

（2）结合保留时间与异源标签：使用同位素标记、异源标签（如TMT/iTRAQ），结合LC保留时间区分异构体

（3）高级数据分析：引入机器学习或AI算法，从多维度（碎片图谱、同位素分布、保留时间）提高异构体区分能力

随着质谱技术、数据分析算法及AI技术的快速发展，肽测序的分辨率、灵敏度和准确度将持续提升。多酶策略、ETD/ECD技术、AI算法和高分辨质谱的结合，将使复杂样本中的低丰度肽段、罕见修饰和同分异构体的识别更加可靠。百泰派克生物科技依托高端质谱平台（包括Orbitrap Fusion、Q-Exactive HF-X）和先进的数据处理算法，结合自主开发的样品前处理与数据分析流程，为客户提供从样品制备、酶解优化到肽段鉴定和修饰定位的一体化解决方案。我们的服务团队深谙肽测序常见问题及优化策略，致力于帮助客户快速从实验失败走向数据精准，为蛋白组学研究和药物开发提供坚实保障。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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