一、Edman降解的化学原理

1、偶联：异硫氰酸苯酯（PITC）与蛋白质/多肽的N端α残基反应。

2、环化裂解：苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）环化裂解。

3、转化：噻唑呤酮苯胺（ATZ）转化为苯异硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）。

Edman降解的化学原理

二、Edman测序仪的基本操作步骤

1、首先打开高纯氩气阀使分压为0.5mp，然后依次开泵，检测器和测序仪主机开关，等待检测器自动检测完毕后，开计算机。

2、打开计算机操作软件到主菜单控制界面，按照操作指南准备测序前工作，如各种试剂和PTH-氨基酸配制装载，HPLC系统洗脱液的准备等，注意每次测序前一定要仔细观察每种试剂和洗脱液能够保证此次测序能够顺利完成。

3、样品测序仪反应室前的预处理，首先在反应室上部玻璃块加上新的玻璃纤维滤膜片，加Biobrene，干燥后上机进行预循环。在经过预循环的玻璃纤维膜片上加入蛋白样品，样品干燥后，再在其上面覆盖一微孔聚四氟乙烯（teflon）滤膜，将上下两个玻璃柱体倒置后装入反应夹套中固定。

4、在计算机上编制本次测序的程序。如样品名，选择循环方法，设定循环数目，标准氨基酸和样品进样量等。

5、将HPLC系统调整到优化状态，预先做一标准氨基酸循环，检查所有PTH-氨基酸时候得到基线分离。

6、测序完毕，关机。

7、分析HPLC图谱数据，与标准HPLC图谱进行对比，从而对氨基酸进行鉴定。

三、Edman测序分析PTH-氨基酸的原理

总的来说，在每个测序循环中，首先先由Edman测序仪分离的PTH-氨基酸，接着使用HPLC分别测定PTH-氨基酸图谱，再与20中氨基酸的标准HPLC图谱，从而得到对应的氨基酸的信息。下图中显示了20个氨基酸的标准HPLC图谱。

Edman测序仪标准PTH-氨基酸HPLC图谱

四、蛋白质N端封闭案例

Edman降解法作为现有蛋白质样品N端序列测试的黄金标准，已得到广泛应用。但是在实际应用中，Edman降解法也有一定的局限。例如，我们有一位客户送来样品，想要对一个的在芽孢杆菌中表达的重组蛋白的N端进行测序。然而我们将样品转移到PVDF膜上之后测序过程中没有任何信号，并且重复的依然如此，根据我们的经验我们推测重组表达蛋白可能发生了N-末端封闭。

五、那么什么是蛋白N端封闭呢？

蛋白质的N端在未封闭的情况下具有自由的α氨基，PITC与α氨基反应是Edman降解测序反应的第一步。当蛋白质N端发生封闭时，N端的α氨基被修饰使得N端缺乏自由的α氨基，导致PITC实际无法与蛋白质结合，使得Edman降解反应无法进行下去。其实在自然界中，50%的天然蛋白质N端都经过了修饰，常见的修饰包括乙酰化、甲基化、焦谷氨酸化等。另外，有时在蛋白样品的分离提纯过程中也有可能产生N端封闭修饰，这个主要是由于溶液中的去垢剂或化学物质与蛋白样品N端功能基团反应，或者分离提纯使用的溶剂的pH值过高导致的。

由于目前Edman降解法用于蛋白质N端封闭的情况是无法进行测序的。在这种情况下可以通过蛋白酶切成多肽片段再使用液相色谱与质谱联用的方法进行序列测定，如果造成蛋白质N封闭的修饰是已知的，可以使用相对应的蛋白酶切除N端的修饰，接着就可以使用Edman降解反应进行测序。例如，许多抗体类药物的N端存在焦谷氨酸环化封闭，当使用焦谷氨肽酶酶解后，就可以直接使用Edman降解法对抗体进行测序工作。

六、影响Edman降解结果的因素

1、测序使用的化学试剂如果纯度不够高，也有可能在PTH色谱中产生假峰，从而影响对氨基酸序列的准确判定。

2、由于各种氨基酸残基化学或物理性质不同，因此判断其含量时PTH信号的强弱会发生变化。例如，酪氨酸和丝氨酸容易发生脱羟基造成峰值发生变化，当半胱氨酸发生修饰时很难检测到信号，组氨酸和精氨酸由于极性难以被萃取，甲硫氨酸容易被氧化，这些因素都会导致峰值相应较低。

3、带有修饰残基在检测时表现出与其他未修饰氨基酸相似的峰也会造成氨基酸识别错误。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

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